重磅！我国科学家揭示CAR-T细胞触发细胞因子释放综合征机制

尽管用经过基因改造后表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞（CAR-T细胞）治疗B细胞恶性肿瘤的临床应用取得了成功，但是细胞因子释放综合征（CRS）却阻碍了这种疗法在患者中的有效性。众所周知，CRS是由急性炎症反应触发的，其特征是发烧、低血压和与血清细胞因子升高有关的呼吸功能不全。尽管人们已报道在经过CAR-T细胞治疗的人源化小鼠模型中，巨噬细胞参与了CRS的发病机制，但触发CRS的机制尚不清楚。输注到患者体内的CAR-T细胞经历活化和增殖，快速增殖的CAR-T细胞可能会在短时间内导致B白血病细胞迅速大量死亡。巧合的是，急性淋巴细胞白血病（ALL）患者的疾病负担也与CRS的发生率和严重程度密切相关。如此大规模的恶性B细胞死亡参与CRS发病机制的方式仍不明确。

细胞可以经历不同类型的死亡。细胞凋亡最初被认为是唯一的受到调控的程序性死亡形式。但是，近期研究已证实了一种以前未被识别的程序性坏死，其特征是细胞快速肿胀、质膜上出现较大的气泡以及促炎因子释放。至少已鉴定出两种程序性坏死细胞死亡途径，包括MLKL介导的坏死性凋亡（necroptosis）和GSDMD（Gasdermin D）或GSDME（Gasdermin E）介导的细胞焦亡（pyroptosis）。

将RIPK1招募到TNF-α受体上可与RIP3形成一种死亡复合物，随后产生膜纳米孔，从而导致坏死性凋亡。不同于MLKL的是，GSDMD或GSDME由炎性半胱天冬酶（caspase 1、caspase 4、caspase 5和小鼠caspase 11）或caspase 3激活，可形成插入到细胞膜中的寡聚物而形成纳米孔，因而介导细胞焦亡。

在一项新的研究中，来自中国医学科学院、郑州大学、华中科技大学和北京大学的研究人员提供的证据表明，人类B白血病细胞和其他靶肿瘤细胞表达了足够数量的GSDME，所表达的GSDME可被由CAR-T细胞释放的颗粒酶B激活的caspase 3高效激活，从而导致靶细胞遭受细胞焦亡。细胞焦亡释放的因子刺激巨噬细胞产生促炎性细胞因子，这很可能触发接受CAR-T细胞治疗的患者中发生的CRS。相关研究结果发表在2020年1月17日的Science Immunology期刊上，论文标题为“Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome”。

图片来自Science Immunology, 2020, doi:10.1126/sciimmunol.aax7969

这些研究人员发现CAR-T细胞由于释放大量穿孔素和颗粒酶B而激活了B白血病细胞中的caspase 3-GSDME途径，从而导致细胞焦亡和随后的CRS。已观察到CAR-T细胞经历增殖过程并在体内的某个时间点达到极高的增殖频率。因此，在相对较短的时间内，大多数靶细胞可能会经历细胞焦亡，导致受到激活的巨噬细胞通过活化的caspase 1产生IL-6和IL-1β，从而触发CRS。阐明这种分子机制为CRS严重程度与CAR-T细胞在治疗期间的数量和B白血病细胞负荷有关的临床观察提供了深刻的见解。

在人类B白血病细胞、MCF-7乳腺癌细胞和小鼠B16黑色素瘤细胞中检测到GSDME表达是出乎意料的，这是因为它作为一种孔形成蛋白发挥作用，而且它的激活是潜在危险的，并且可能导致细胞死亡。据报道，GSDME在许多检测到的肿瘤细胞系中不表达。与此相一致的是，GSDME基因的启动子区域显示出高甲基化状态，这就表明GSDME基因在细胞中遭受表观遗传沉默。 GSDME被认为是一种通过caspase 3裂解诱导程序性细胞死亡的肿瘤抑制基因，并且肿瘤细胞可能已进化出表观遗传学手段来沉默GSDME表达，从而允许肿瘤发生。然而，GSDME在B白血病细胞和其他肿瘤细胞中的高表达提示着GSDME很可能对肿瘤细胞中的孔形成发挥替代作用。人们目前正在研究GSDME表达克服高甲基化调控的方式以及GSDME是否具有除孔形成以外的常规功能目前正在处于研究当中。

这项研究的重要发现是CAR-T细胞比未转导的天然T细胞释放更多的穿孔素/粒酶B。T细胞释放溶细胞性效应分子取决于两种信号的激活：MHC-抗原肽-TCR（信号1）和CD80/CD86-CD28（信号2）。信号2的完全激活取决于TCR信号的激活强度。TCR信号激活的轻链激酶（LCK）使得CD28酪氨酸残基发生磷酸化；与此同时，TCR信号激活的LAT和SLP-76磷酸化和激活关键的CD28下游信号分子PLC-γ，因而将磷脂酰肌醇4,5-双磷酸（PIP2）降解为二酰甘油（DAG）和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）。

基于对T细胞激活的了解和基因工程取得的进步，这些研究人员设计出针对人类T细胞的合成CAR。设计CAR的基本概念是将单链可变区片段（scFv）与CD3ζ细胞内信号转导模块连接在一起，以在抗原结合后诱导T细胞激活。当前，这种模块化结构已从单个CD3ζ信号结构域扩展到CD3ζ-CD28、CD3ζ–4-1BB或CD3ζ–CD28–4-1BB信号结构域，以模拟信号1和信号2。

鉴于CAR与其抗原之间的亲和力可能比TCR与MHC-肽复合物之间的亲和力高100倍，因此这种优越的亲和力加上共刺激信号使得CAR-T细胞能够释放大量的穿孔素/粒酶B，这是CAR-T细胞介导的靶细胞经历细胞焦亡所必需的。一旦进入细胞质后，颗粒酶B可以将caspase 3的无活性前体（procaspase 3）裂解为它的活性形式。活化的caspase 3诱导细胞凋亡或裂解GSDME，这种理解通过膜孔形成触发细胞焦亡。但是，细胞具有快速修复质膜中形成的孔的能力。GSDME是否触发细胞焦亡取决于膜孔形成与膜修复之间的平衡。尽管具有相同的GSDME数量，但是天然的TCR CD8+ T 细胞仅导致低水平的GSDME裂解，而CAR-T细胞释放出更高水平的穿孔素/粒酶B，因而导致更多的GSDME激活。

由于释放富含损伤相关分子模式（DAMP）分子的细胞质内容物，细胞焦亡中发生的裂解具有高度促炎性。在这项研究中，这些研究人员证实肿瘤细胞经历的细胞焦亡导致巨噬细胞中的caspase 1和GSDMD的激活，从而导致大量促炎细胞因子的释放和CRS的发生。在这些促炎细胞因子中，IL-6和IL-1β尤为重要。临床上，中和IL-6的抗体被广泛用于预防和/或治疗接受CAR-T细胞治疗的患者中发生的CRS。作为多效细胞因子，IL-6主要受到NF-κB、AP-1和STAT3等转录因子的调节。诸如脂多糖（LPS）之类的病原体相关分子模式（PAMP）分子和诸如热休克蛋白（HSP）和HMGB1之类的DAMP分子可通过激活这些转录因子来刺激巨噬细胞产生IL-6。

这些研究人员发现HMGB1存在于细胞焦亡的上清液中，因而直接激活巨噬细胞中的IL-6。 IL-1β是以前体形式合成的，它的释放取决于caspase 1的激活，caspase 1是一种受到炎性体严格调节的促炎性半胱天冬酶。炎性体NLRP3已被包括微生物毒素、颗粒物、晶体、β-淀粉样蛋白聚集物或细胞外ATP在内的多种刺激物广泛激活。

在这项研究中，这些研究人员发现细胞焦亡的上清液含有ATP，用P2X7受体拮抗剂处理或降解ATP可抑制细胞焦亡的上清液激活巨噬细胞中caspase 1的能力。在他们开发的小鼠CRS模型的帮助下，他们进一步证实不论是敲除靶肿瘤细胞中的GSDME，也不论是剔除巨噬细胞，还是抑制caspase 1/GSDMD都可阻止CRS的发生。阐明这种分子途径对于更好地了解与CAR-T细胞疗法相关的毒性至关重要。2018年，Verena Staedtke等人已发现儿茶酚胺阻断剂可以抑制巨噬细胞释放促炎性细胞因子。因此，对GSDME和儿茶酚胺的联合阻断可以在不降低肿瘤清除的情况下更好地治疗CRS。

尽管这项研究报道CAR-T细胞通过GSDME依赖性途径诱导靶肿瘤细胞遭受细胞焦亡，但也可能存在其他途径来介导CAR-T细胞引起的靶细胞焦亡。近期研究已报道CAR-T细胞可能动员TNF-α来介导这种杀伤过程，不过这可能与颗粒酶B和穿孔素无关。这项发现的一种可能性是CAR-T细胞可以使用一种两步骤策略来攻击靶细胞。颗粒酶B和穿孔素引发了第一波杀伤，如果靶细胞逃脱了第一波攻击，那么TNF-α就会发起第二波杀伤。这也可能解释了为何细胞焦亡可在不显著影响CAR-T细胞介导的杀伤作用的情况下不被阻断。当前的这项研究揭示了CAR-T细胞和天然的TCR-T细胞导致的细胞死亡类型之间存在机制上的差异，这就为通过将肿瘤细胞死亡从细胞焦亡切换到细胞凋亡来修饰CAR以减少CRS提供了机会。

参考资料：

Yuying Liu et al. Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome. Science Immunology, 2020, doi:10.1126/sciimmunol.aax7969.